| 1. |
付属の 解凍液 をあらかじめウォーターバスやインキュベーターで、37℃ に温めておきます。 解凍液 は、凍ったままウォーターバスやインキュベーターに入れて、温めてください。 |
| 2. |
37℃に温めておいた 解凍液 をクリーンベンチ内に用意しておきます。 |
| 3. |
ディープフリーザー (-80℃) から BBBキット ™を取り出し、すばやくクリーンベンチの中に入れ、中身を出します。 BBBキット™ を密封しているセロファンの袋は、必ず、クリーンベンチの中で、はずしてください。
（BBBキット™ は構造上とても溶けやすいので、ディープフリーザーから取り出し解凍するまでの工程は、すばやく行ってください。） |
| 4. |
取り出した BBBキット ™の表面に、氷や水滴がついている場合は、消毒用エタノールを噴霧し、キムワイプなどでふき取ってください。このとき、プレートを逆さまにしないように注意してください。またプレートの表面についた水滴をキットの中に入れないように注意してください。 |
| 5. |
このあと直ちに、凍った状態のままの BBBキット™ に、解凍液をプレートの脳側に、1000 μL ずつ添加します
（12 well分）。脳側に 解凍液 を添加するときは、インサートのすき間から添加してください。
*脳側（アストロサイト播種部位）は懸濁しないでください。
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※5. 〜 7. の工程において、ピペットの先でメンプレンに触れたり、インサートをはずしたり動かしたりしないように注意してください。
アストロサイトが均一に分散されず、BBBキットが正常に機能しない場合があります。 |
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| 6. |
脳側に 12 well分添加したあと、血管側 （インサートの内側） に 解凍液 を 630 μLずつ添加します（12 well 分）。
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| 7. |
血管側 （インサートの内側） の細胞を分散させるため、ピペッターで 5 〜 10 回ほど軽く懸濁する（12 well 分）。
解凍作業終了後、プレートの表面と底に残っている水滴を消毒用エタノールで濡らしたキムワイプ等で拭き取ってください。 |
| 8. |
CO2 インキュベーターで、2 〜 3 時間培養します。このとき 培養液１ を 37℃ に温めておいてください。 |
| 9. |
2 〜 3 時間培養後、倒立顕微鏡で細胞が張り付いていることを確認してください。PBC-12 (PC-12) 型では、ポリカーボネイト製メンブランの特性上、内皮細胞が観察されません。
RBE-12型
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| 内皮細胞（強拡） |
アストロサイト（強拡） |
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| 10. |
インサートをピンセットで持ち上げ、脳側の 解凍液 を吸引します。インサートを戻し、37℃ に温めていた 培養液１ をインサートのすき間から 1500 μL 脳側に入れます （赤矢印）。次に、血管側 （インサート内） の 解凍液 を吸引し、37℃ に温めていた 培養液１ を 500 μL 加えます。この作業を繰り返し、BBBキット™ すべての well の 解凍液 を 培養液１ に交換します。
（細胞を傷つけないよう 1 well ごとに吸引して、培養液１ の添加は丁寧に行ってください。）
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| 11. |
CO2 インキュベーターで、一昼夜培養します。 |
